现场传染病诊断关键技术的研究及应用

【摘要】本研究针对现场传染病诊断的需求，针对现场核酸提取、现场快速分子诊断方法的选取、现场快速检测平台的建立等关键技术展开研究，并将研究成果应用在现场传染病诊断上。2000年Notomi等人建立了一种新颖的体外核酸扩增技术，即环介导恒温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，简称LAMP），这种新颖的扩增方法需要至少4条引物，最多6条引物来特异性识别目标片段的6个、7个或者8个独立区域，在DNA聚合酶的链置换作用下可以在很短的时间内将靶序列扩增出来，具有简单、特异、高效、迅速的特点，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物的产生，即白色的焦磷酸镁沉淀，这一特性可以使LAMP反应的过程中通过浊度的变化来直接判断阴阳性结果。PCR需要两条引物来特异性结合靶序列的两个区间，而LAMP则是特异性的结合6至8个区间，所以相较于PCR来说具有很强特异性，敏感性比普通PCR相比可以提高10-100倍，与荧光定量PCR的敏感性相当，但LAMP扩增的过程是在恒温条件下进行的，有热稳定的设备（比如恒温水浴锅、恒温金属浴等）就能满足反应要求，所以检测成本就大大降低了。自从LAMP技术被报道后，在短短的十几年的时间里，已经被广泛应用于细菌、真菌、病毒等微生物的检测，遗传病的诊断，性别的早期判定等领域。简单快速的LAMP检测方法需要简单快速的核酸提取试剂盒与之相匹配，这样就能充分发挥其优势。目前市场上的病毒核酸提取试剂盒主要有两种，一是全自动核酸提取仪，因其价格昂贵，体积大，需要专业人士维护而主要应用于大型医院和国家大型实验室。二是普通核酸提取试剂盒，因其需要离心机、操作繁琐、耗时长、专业化程度需求高而主要应用于全国科研单位。而基层单位往往是传染病暴发的起点，如果能就地快速进行核酸诊断将对传染病的防控起到积极的作用，而核酸提取是防控的第一步，根据现场或者基层的医疗条件，对核酸提取试剂盒的需求为快速、操作方便、使用简单、无仪器化、专业化需求低。我们从现场核酸提取的需求出发研发了核酸提取试剂盒，本试剂盒操作简单，无需任何仪器，常温保存，能有效防止交叉污染，专业化程度需求低，无需提前配液，无需加样枪，提取纯度高，15分钟内可以提取完成，适用于咽拭子、痰液、肛拭子等样本病毒DNA/RNA的快速提取。LAMP技术可以在短时间内将目标片段扩增1010倍，是PCR的100-1000倍，高效扩增的同时也带来了另一个大问题，气溶胶的污染，这也是LAMP技术推广遇到的最大的问题，气溶胶的污染带来假阳性，而且是非常严重的假阳性，这也是每一个LAMP研究者遇到的非常棘手的一个问题，如何避免气溶胶的污染也是大家共同致力解决的问题，实验分区是大家普遍采用的一个手段，但并不能从根本上解决问题，我们提出了一个从源头控制扩增产物的方法，可以非常好的解决形成气溶胶的问题，我们发明了一种封闭剂，本封闭剂在实验前加入，为固态，在反应过程中为液态，可以很好的防止气溶胶的形成，在反应完成后又变为固态，将扩增产物完全封闭于管底，这样就杜绝了扩增产物挥发形成气溶胶而形成假阳性，可以很好的解决因为扩增产物而带来的假阳性。目前有以下几种方式判定LAMP反应的结果：电泳、SYBRGreenⅠ染色、沉淀法、浊度法、钙黄绿素染色、羟基萘酚蓝染色（HNB）等，这些方法有一个共同点：均是通过间接的方法来判定LAMP结果，无法对扩增产物进行直接的判定，如果产生了非特异扩增，那么这些检测方法均无法判断，这也是LAMP技术遭遇的另一个大的问题，如何对扩增产物直接检测也成了LAMP技术的难点，我们从TaqMan探针荧光定量PCR技术得到启示，将TaqMan探针引入到LAMP技术，从而实现了对扩增产物的直接检测，也就从根本上解决了非特异扩增的问题。基于TaqMan探针的LAMP法具有巨大的应用价值和商业价值。LAMP法面临的另一个大的问题就是能否实现绝对定量，临床上的一些病毒检测要求绝对定量，LAMP法将来要走向临床应用，就必须克服这一问题，因为LAMP扩增的过程非常复杂，产物片段大小不一，至今也没有一个完整的数学模型，也就没有一个数学推导公式来支持LAMP的定量应用，我们在试验中发现对于一些一定浓度的模板，LAMP的重现性非常好，而对于另外一些浓度的模板，则其的重现性变的不规律，总结起来就是，在105拷贝浓度以上时LAMP可以实现绝对定量，R2在0.99以上，而在105拷贝浓度以下时，则无法实现绝对定量，之所以有如此的结果，我们推测与LAMP复杂的反应原理有关，模板浓度越低发生反应的随机性就变大，从而导致低浓度模板重现性降低。在解决了样本前处理，LAMP易污染假阳性高的问题，非特异扩增的问题，定量的问题后，我们建立了基于环介导恒温扩增法快速检测技术平台，主要致力于开发临床常见病原微生物快速检测试剂盒，以及处置常发、新发、突发传染病疫情。在平台的基础上我们开发了一系列快速检测试剂盒，主要包括腹泻相关的病原菌检测试剂盒。近年来新发、突发传染病逐渐增多，2003年，SARS病毒；2009年，新的型甲型H1N1流感病毒；2010年，超级细菌NDM-1；2011年，新型肠出血性大肠杆菌造成的毒黄瓜事件；2012年，55型腺病毒；2013年，人感染H7N9禽流感病毒等，简单、快速、灵敏的检测方法对于控制疫情蔓延会起到很好的作用，从而早发现、早诊断、早干预，我们利用已经建立的基于LAMP技术的恒温快速检测技术平台，研发了超级细菌耐药基因NDM-1快速检测试剂盒，腺病毒55型14型7型快速检测试剂盒，人感染H7N9禽流感病毒快速检测试剂盒，为应对大规模疫情的爆发做好了物资储备和技术储备。本研究致力于现场传染病诊断关键技术的研究，主要是环介导恒温扩增法关键问题的解决，为LAMP技术在现场应用扫除障碍，并最终建立了基于环介导恒温扩增法的现场快速检测技术平台，可以为应对常发、新发、突发传染病提供技术支持。
【作者】刘威；
【导师】黄留玉；袁静；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，军事预防医学，2014，博士
【关键词】LAMP；现场快速检测；传染病；床旁检测；

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